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熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)
點擊次數(shù)：7754 日期：2013/11/26 15:44:36
一、熒光定量PCR技術(shù)簡介及原理
熒光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，從而對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR過程中，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。實時熒光定量PCR技術(shù)是一次DNA定量技術(shù)的飛躍，運用該項技術(shù)，可以對DNA 、RNA樣品進行定量和定性分析。
二、熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。
動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。
科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
三、熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)名稱 內(nèi)容說明
qPCR—引物設(shè)計 引物設(shè)計
qPCR—構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 用于絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品
qPCR—標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進行定量，計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線
qPCR—相對定量 每個樣品重復(fù)三次，內(nèi)參重復(fù)三次，包含反轉(zhuǎn)錄、引物合成費用、內(nèi)參基因費用
qPCR—絕對定量 含標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)曲等
四、實驗要求
客戶提供：
1.進行mRNA表達量分析時，如果提供的材料為Total RNA，請寄送足量的并且保證純度的Total RNA(濃度在200 ng/μl以上，體積在20 μl
以上，純度A260/280在1.8-2.0間)。如果目的基因表達量低時，應(yīng)盡量提供更高濃度的Total RNA。
2.如果提供的材料為細(xì)胞或組織，DNA、RNA的提取費用另收。 同時應(yīng)保證材料新鮮，動物細(xì)胞數(shù)為106以上，動物組織為100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、關(guān)鍵詞)，mRNA需說明具體剪接子及檢測范圍（公共區(qū)域或特異性區(qū)域）。
4.引物設(shè)計的區(qū)域范圍(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：樣品質(zhì)檢報告、實驗設(shè)計報告、定量結(jié)果報告（擴增反應(yīng)報告、溶解曲線報告和熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果及柱狀圖）。
五、注意事項及常見問題
Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？
A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻選擇合適的內(nèi)參。對于一些無法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實驗。
Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？
A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計引物。
Q: 絕對定量與相對定量有什么區(qū)別？
A：絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量實驗有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
熒光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，從而對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR過程中，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。實時熒光定量PCR技術(shù)是一次DNA定量技術(shù)的飛躍，運用該項技術(shù)，可以對DNA 、RNA樣品進行定量和定性分析。
二、熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。
動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。
食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。
科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
三、熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)名稱 內(nèi)容說明
qPCR—引物設(shè)計 引物設(shè)計
qPCR—構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品 用于絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品
qPCR—標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進行定量，計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線
qPCR—相對定量 每個樣品重復(fù)三次，內(nèi)參重復(fù)三次，包含反轉(zhuǎn)錄、引物合成費用、內(nèi)參基因費用
qPCR—絕對定量 含標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)曲等
四、實驗要求
客戶提供：
1.進行mRNA表達量分析時，如果提供的材料為Total RNA，請寄送足量的并且保證純度的Total RNA(濃度在200 ng/μl以上，體積在20 μl
以上，純度A260/280在1.8-2.0間)。如果目的基因表達量低時，應(yīng)盡量提供更高濃度的Total RNA。
2.如果提供的材料為細(xì)胞或組織，DNA、RNA的提取費用另收。 同時應(yīng)保證材料新鮮，動物細(xì)胞數(shù)為106以上，動物組織為100 mg以上。 3.目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、關(guān)鍵詞)，mRNA需說明具體剪接子及檢測范圍（公共區(qū)域或特異性區(qū)域）。
4.引物設(shè)計的區(qū)域范圍(全序列、5′端序列、3′端序列)。
公司提供：樣品質(zhì)檢報告、實驗設(shè)計報告、定量結(jié)果報告（擴增反應(yīng)報告、溶解曲線報告和熒光定量數(shù)據(jù)結(jié)果及柱狀圖）。
五、注意事項及常見問題
Q: 如何選擇合適的內(nèi)參基因？
A：常見物種做mRNA使用actin做內(nèi)參，miRNA檢測使用U6做內(nèi)參，特殊物種根據(jù)文獻選擇合適的內(nèi)參。對于一些無法確定內(nèi)參的物種，我們可以提供內(nèi)參基因篩選服務(wù)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參用于后續(xù)實驗。
Q: 引物出現(xiàn)非特異怎么解決？
A：提高退火溫度；減少引物量；重新設(shè)計引物。
Q: 絕對定量與相對定量有什么區(qū)別？
A：絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量實驗有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個已知pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。
