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解決方案
免疫組化的實(shí)驗(yàn)總結(jié)
點(diǎn)擊次數(shù)：8645 日期：2014/3/27 15:27:58
免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學(xué).
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體.
操作要點(diǎn)和技巧
1．固定：*好用4%的多聚甲醛固定液.對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液.有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液,請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書(shū).
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存.
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片.適于富含糖類(lèi)組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好.
2．組織脫水,透明：時(shí)間不能太長(zhǎng),否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整.
3．切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開(kāi),這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖?
4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過(guò)夜,溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原容易丟失.
5．蠟塊及切片的保存：*好在4℃保存
6．脫片問(wèn)題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中*常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理.如不行,可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片.在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法：切片在脫蠟前,放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步.
7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活.
8．暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的*佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書(shū)).對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化.膠原還可以用胃蛋白酶消化等.
9．封閉：在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10．抗體稀釋?zhuān)簯?yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用.
11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗.
12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán).
13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景.
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體.
操作要點(diǎn)和技巧
1．固定：*好用4%的多聚甲醛固定液.對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液.有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液,請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書(shū).
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存.
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片.適于富含糖類(lèi)組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好.
2．組織脫水,透明：時(shí)間不能太長(zhǎng),否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整.
3．切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開(kāi),這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖?
4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過(guò)夜,溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原容易丟失.
5．蠟塊及切片的保存：*好在4℃保存
6．脫片問(wèn)題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中*常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理.如不行,可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片.在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法：切片在脫蠟前,放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步.
7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活.
8．暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的*佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書(shū)).對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化.膠原還可以用胃蛋白酶消化等.
9．封閉：在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10．抗體稀釋?zhuān)簯?yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用.
11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗.
12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán).
13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景.
